B1-1 機能ゲノミクス解析支援

ユニット名

発現・機能解析ユニット

支援担当者

所属 ① 理化学研究所 生命医科学研究センター
氏名 ① 桃沢 幸秀
AMED
事業
課題名 生体試料を用いた大規模機能ゲノミクス解析支援及びヒト免疫機能評価基盤の高度化
代表機関 理化学研究所
代表者 山本 一彦

支援技術のキーワード

大規模機能ゲノミクス解析、シングルセルRNA-seq、バルクRNA-seq、ゲノムシーケンス解析、統合データ解析

支援技術の概要

実験計画から、サンプル受領、核酸抽出、ライブラリー調製、シーケンス、データ解析までの機能ゲノミクス解析について、プロセスごとにコンサルテーションを行いながら統合的に支援する。

<ライブラリー作製、シーケンス解析、統合データ解析>

①CAGE解析(転写開始点解析):理研で独自開発したssCAGE法を用いて、5'端のCAP構造を有するRNA分子(mRNA, long non-coding RNA, enhancer RNAなど、non-poly(A) RNAも含む)を特異的に捉える技術。得られたデータからFASTQ、TSSデータを生成し、網羅的かつ定量的にプロモーターおよびエンハンサー活性ならびに遺伝子の転写開始点を測定し、遺伝子アノテーション、活性推定などの解析結果を提供する。

②シングルセルRNA解析:外部研究者等の目的に応じて、RamDA-seq、SMART-seq、3’ Gene Expression(10xGenomics社)の3種の方法によりシングルセルRNA解析の支援を実施する。

・RamDA-seq:理研で開発されたRT-RamDA法を用いて、1細胞毎の全トランスクリプトームシーケンス用のライブラリーを調製する。得られたデータからFASTQ、Count、FPKM-TPMデータを生成し、網羅的かつ定量的にポリA型RNA、非ポリA型RNA、エンハンサーRNAを測定する。遺伝子アノテーション、遺伝子発現量などの解析結果を提供する。

・SMART-seq:SMART-seq2法を用いて、1細胞毎の全トランスクリプトーム解析を行う。得られたデータからFASTQ、Read Count、FPKM/TPMデータを生成し、網羅的かつ定量的にポリA型RNAを測定する。遺伝子アノテーション、遺伝子発現量などの解析結果を提供する。

・シングルセル遺伝子発現解析(10xGenomics):10xGenomics社Chromium Controllerを使用して、500~10,000細胞のシングルセルを用いたライブラリー調製を行う。得られたデータからLoupe Browser用のloupeファイルとCell Rangerで出力したhtmlファイルを生成し、網羅的かつ定量的にポリA型3’ RNAを測定する。遺伝子アノテーション、遺伝子発現量などの解析結果を提供する。

③バルクRNA解析:以下の2種の方法によりバルクRNA解析を実施する。実験デザインの相談から、ライブラリーの構築、シーケンス、データ解析、統計解析まで一貫して支援する

・RNA-seq:Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina(NEB社)を用いて、ストランド非特異的なcDNAライブラリーを調製する。rRNA除去またはpoly(A) mRNA濃縮と併用することで、10 ngから1μgまでのTotal RNAから高品質なライブラリーを調製する。得られたデータからFASTQ、Read Count、FPKM/TPMデータを生成し、網羅的かつ定量的にポリA型RNAを測定する。遺伝子アノテーション、遺伝子発現量などの解析結果を提供する。

・3' mRNA-Seq:QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kit(Lexogen社)を用いて、poly(A) mRNAの3'末端近郊配列をもつcDNAライブラリーを調製する。得られたデータからFASTQ、Read Count、FPKM/TPMデータを生成し、網羅的かつ定量的にポリA型3’ RNAを測定する。そして、遺伝子アノテーション、遺伝子発現量などの解析結果を提供する。

④ターゲットシーケンス解析:理研で独自開発されたmultiplex PCRを用いた手法により、ゲノムDNAを材料として、特定の遺伝子(領域)に絞って多数検体のシーケンス解析を行う。実験デザインのコンサルテーションから、ライブラリーの調製、シーケンス、データ解析、統計解析まで一貫して支援する。

⑤全ゲノムシーケンス解析:ゲノムDNAを材料として全ゲノムシーケンスを実施する。実験デザインのコンサルテーションから、ライブラリー調製、シークエンス解析、バリアントリストの作成や疾患やフェノタイプとの関連解析までを一貫して担当する。

⑥統合データ解析:上記の機能ゲノミクス解析を対象として、複数のゲノミクス解析結果を統合的に解析するマルチゲノミクス解析を支援する。特に、RNAとゲノム変異や多変量解析等の異なる手法に基づくデータの統合解析を支援するとともに、ターゲットの絞り込み、各種統計手法を用いた検証等多面的な解析支援を行う。また、支援先自体のデータ解析を可能とするために、様々なツールの提供および解析手法に関するコンサルテーションを行い、データ解析技術の展開も併せて行う。

支援技術の利用例

10万人以上を対象としたBRCA1/2遺伝子の14がん種を横断的解析
-東アジアに多い3がん種へのゲノム医療の可能性-

理研が独自に開発したターゲットシークエンス法により、バイオバンク・ジャパンが保有している日本人集団における14種のがんについて、がん患者とその対照群の合計10万人以上を対象とした世界最大規模のがん種横断的ゲノム解析を行った。その結果、BRCA1/2遺伝子は既に関連が知られている乳がん、卵巣がん、前立腺がん、膵がんの4がん種に加えて、東アジアに多い胃がん、食道がん、胆道がんの3がん種の疾患リスクを高めることを発見した。この結果は、BRCA1/2遺伝子に病的バリアントを持つ患者に対して、既知の4がん種だけでなく新たに同定した3がん種についても、早期発見スクリーニングの実施や、PARP阻害剤の治療効果が期待できることを示した。(Momozawa Y et al. JAMA Oncol.2022) 

支援担当者の研究概要

支援に必要とされる要素技術とデータ解析の開発(高度化)を行う。大規模機能ゲノミクス解析支援に係るDNA/RNA 解析技術の高度化に加え、ゲノム研究を機能ゲノミクス研究に結び付ける方法論の確立を目指し「ヒト免疫機能評価」研究を対象領域とした高度化を実施する。機能ゲノミクス分野の高度化では、支援として多く利用が見込まれるDNA/RNA 解析技術を選択し、技術開発及びメニュー化を目指すとともに、当該分野における新たな技術開発の動向に応じて、新規技術の?度化について企画・検討する。ヒト免疫機能評価研究における
高度化として、ヒト免疫システムを構成する多様な免疫担当細胞サブセットの機能解析の進歩を目指す。

大規模機能ゲノミクス解析支援に係るDNA/RNA技術の高度化
・シングルセルRNA解析の低コスト化及び自動化
・Somatic全ゲノムシーケンス解析
・Somaticターゲットシーケンス解析

免疫細胞のサブセット解析と遺伝的変異との関連付けを目的としたDNA/RNAを中心とした多層的な機能分子の解析技術の高度化
・細胞分離法の高度化
・次世代シーケンサー(NGS)を用いた大規模解析の高度化
・転写因子結合部位マッピングと遺伝的変異
・ゲノム編集実験システムの確立

※高度化課題の社会への普及・実用化に向けた取り組みとして、技術開発を活用した共同(連携)研究を推進する。

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